Ceļā uz Eiropas medus bites Apis mellifera tranu spermas ilgtspējīgiem uzglabāšanas risinājumiem

Priekšvārds.

Sveiciens biškopjiem! Maija mēnesis ir bijis ļoti darbīgs ne tikai tādēļ, ka esam pilnvērtīgi uzsākuši bišu māšu audzēšanas sezonu un pirmās bišu mātes jau ir devušās uz savām jaunajām mājām, bet arī tādēļ, ka man bija brīnišķīga iespēja piedalīties starptautiskajā zinātniskajā konferencē CONECT 2023 no 10.05.2023. līdz 12.05.2023.

CONECT ir Rīgas Tehniskās universitātes Vides aizsardzības un siltuma sistēmu institūta (RTU VASSI) organizēta starptautiska zinātniskā konference, kas veltīta vides un klimata tehnoloģijām. Šis bija 16. gads, kad šī konference notiek, un šogad Rīgā viesojās 125 pētnieki no 24 valstīm, lai prezentētu savus sasniegumus vides inženierzinātnēs.

Arī man bija lieliska iespēja šogad prezentēt savas zinātniskās publikācijas, kuras es izstrādāju savas doktorantūras studiju ietvaros. Manas doktora disertācijas tēma ir Eiropas medus bites ciltsdarba efektivitātes palielināšana, izstrādājot dažādus inženiertehniskos un biotehnoloģiskos risinājumus. Viens no galvenajiem mana darba mērķiem ir meklēt risinājumus, kā ilgstoši uzglabāt medus bišu tranu spermu, lai pēc vajadzības varētu atjaunot unikālu ģenētisko materiālu. Šobrīd notiek aktīva pētniecība šajā virzienā arī citviet pasaulē un cerams, ka mums izdosies sniegt savu ieguldījumu, lai pavisam drīz vienkārša, lēta, pieejama un uzticama tranu spermas uzglabāšana kļūtu par realitāti. Tas būtu milzīgs ieguvums visai biškopības nozarei visā pasaulē!

Pirmā publikācija par šo tēmu jau ir nopublicēta ar nosaukumu “Review of sustainable cryopreservation and above-freezing storage solutions of European honey bee Apis mellifera drone semen” (no angļu val. “Apskatraksts par Eiropas medus bites Apis mellifera tranu spermas ilgtspējīgiem kriosaldēšanas un virs sasalšanas temperatūras uzglabāšanas risinājumiem”). Raksta autori – Agnese Smilga-Spalviņa, Krišs Spalviņš, Ivars Veidenbergs. Jau šobrīd publikācija angļu valodā ir pieejama brīvpieejas starptautiskajā zinātniskajā žurnālā Environmental and Climate Technologies. Pilns orģinālraksts angļu valodā pieejams žurnāla izdevēja SCIENDO mājaslapā - sciendo.com/article/10.2478/rtuect-2023-0014 vai meklējot pēc DOI numura jebkurā interneta meklēšanas rīkā - doi.org/10.2478/rtuect-2023-0014. Pilns raksta tulkojums latviešu valodā pieejams mūsu mājaslapā - https://www.smilga-spalvina.lv.

Šajā “Biškopis” numurā sagatavoju tulkotu kopsavilkumu no šīs publikācijas, lai plašāku Latvijas biškopju loku iepazīstinātu ar sasniegumiem biškopībā.

Ar cieņu – Agnese Smilga-Spalviņa

Attēls: Agnese Smilga-Spalviņa un Krišs Spalviņš CONECT 2023 konferencē. (11.05.2023.)

Ievads.

Viena no Eiropas Zaļā kursa prioritātēm ir ilgtspējīga lauksaimniecības attīstība, lai apturētu bioloģiskās daudzveidības samazināšanos, veidotu veselīgu un ilgtspējīgu pārtikas ražošanas sistēmu un mazinātu riskus saistībā ar pārtikas pieejamību, kas aktualizējās Covid-19 krīzē saistībā ar loģistikas ķēžu nodrošinājumu un saasinājās pēc Krievijas iebrukuma Ukrainā. Stratēģijas “No saimniecības līdz dakšai” (Farm to Fork) ietvaros, lai nodrošinātu ilgtspējīgu pārtikas ražošanas sistēmu ir definēts, ka pārtikas ražošanai jābūt neitrālai vai pozitīvai ietekmei uz vidi, jāpalīdz samazināt ietekme uz klimata pārmaiņām, jānovērš bioloģiskās daudzveidības mazināšanās un jānodrošina ar minerālvielām bagāta un ilgtspējīga pārtika, kas pieejama visiem iedzīvotājiem. Viena no lauksaimniecības nozarēm, kas spēj izpildīt visus iepriekš definētos ilgtspējības nosacījumus ir biškopība, kas pēc būtības ir klimatneitrāla un bezatlikumu lauksaimniecības nozare. Klimatneitralitāte tiek nodrošināta netiešā veidā akumulējot oglekli saražotajos biškopības produktos, tas ir, augi izmanto CO₂ no atmosfēras, lai saražotu oglekļa bagātus savienojumus kā nektāru, ziedputekšņus un augu sulas, ko medus bites izmanto, lai ražotu medu, bišu maizi, propolisu, bišu vasku un bišu māšu peru pieniņu, kā arī dravošanai izmantojot koka stropus, kas var kalpot vairākas desmitgades. Uz 2020. gadu pēc Faostat datiem Eiropā bija reģistrētas aptuveni 19.6 miljoni bišu saimes un tika saražotas aptuveni 389 tūkstoši tonnas medus.

Papildus tam, biškopības nozare ar apputeksnēšanu sniedz ieguldījumu arī citās lauksaimniecības nozarēs augu izcelsmes produkcijas ražošanā, piem., pēc Faostat (2020) datiem Eiropā 10.6% no kopējās saražotās augu izcelsmes produkcijas ir atkarīga tieši no apputeksnēšanas (augļi, ogas, griķi, rapsis, u.c. kultūras). Tiek aplēsts, ka medus bites kopā ar pārējiem apputeksnētājiem katru gadu Eiropā lauksaimniecībā sniedz ieguldījumu 22 miljardu eiro apmērā. Taču dažādu slimību, pesticīdu un klimata pārmaiņu rezultātā bišu saimes tiek novājinātas, tās ir sarežģītāk uzturēt un ik gadu biškopji saskaras ar grūti izskaidrojamiem bišu saimju zudumiem, šo fenomenu mēdz saukt par bišu saimju sabrukuma sindromu (colony collapse disorder), kā rezultātā var samazināties apputeksnēto kultūraugu platības un bioloģiskā daudzveidība. Eiropas Savienībā (ES) jau šobrīd 50% no apputeksnētājiem atkarīgām lauksaimniecības platībām cieš no apputeksnētāju trūkuma.

Vienīgais ilgtspējīgais risinājums bišu saimju saglabāšanai, ģenētiskā materiāla atjaunošanai un ģenētiskās daudzveidības nodrošināšanai ir konsekvents ciltsdarbs, izkopjot slimību izturību un citas ekonomiski nozīmīgas īpašības. Bet arī ciltsdarba nodrošināšanā ir savi stūrakmeņi. Bišu mātes parasti dzīvo 3 līdz 4 gadus, atsevišķos gadījumos arī ilgāk. Parasti par kādas bišu mātes bišu saimju īpašībām gala secinājumus var izdarīt bišu mātes 3. dzīves gadā, jo pirmajā gadā bišu māte tiek iegādāta vai izaudzēta, tā pārziemo ar savām darba bitēm un/vai svešām un 2. gadā tiek iegūti dati par bišu saimes sniegumu visas sezonas griezumā. Ja novērtētā bišu saime ir ar izcilu sniegumu, tad 3. gadā ir jāpieņem lēmums par ģenētiskā materiāla saglabāšanu, izaudzējot nākamās paaudzes bišu mātes, kuru dzīves ilgums arī būs vidēji 3 gadi. No 1. pēcnācēju paaudzes (F1) bišu mātēm tiešā veidā izcilās bišu saimes ģenētisko materiālu var iegūt, audzējot tranus (vīrišķos medus bišu īpatņus), jo tie attīstās no neapaugļotām olām un pārnes tikai vecmāmiņas bišu saimes ģenētisko informāciju, un pēc tam veicot kontrolētu bišu māšu apsēklošanu, izveidojot izolētu staciju vai veicot instrumentālo apsēklošanu. Veicot instrumentālo apsēklošanu jāņem vērā reproduktīvā materiāla vecums, kas būtiski ietekmē apsēklošanas kvalitāti, attiecīgi jaunajām bišu mātēm ir jābūt 5-14 dienas vecām, savukārt traniem 2-3 nedēļu veciem. Izmantojot vecākus īpatņus, samazinās spermas kvalitāte, bišu mātes spermas uzkrājējā nonāk mazāk spermas un palielinās risks, ka bišu māte var nomirt no spermas atliekvielu uzkrāšanās vidusolvados. Ņemot vērā biškopības sezonālo raksturu, laikapstākļu ietekmi un specifisko pārošanās mehānismu, lai nodrošinātu ģenētiskā materiāla saglabāšanu, ir salīdzinoši īsā laika posmā vienlaicīgi jāveic bišu materiāla vērtēšana, reproduktīvā materiāla audzēšana (tranu audzēšana notiek 40 dienas) un krustošana. Papildus tam, pastāv risks dažādu iemeslu dēļ priekšlaicīgi zaudēt ciltsmateriāla bišu mātes, kā arī iegūto jauno krustojumu sniegums var būt krasi atšķirīgs no sagaidāmā. Jauna ģenētiskā materiāla trūkuma arī dēļ pastāv risks izraisīt inbrīdingu.

Lai nodrošinātu iespēju saglabāt un atjaunot vērtīgu medus bišu ģenētisko materiālu ilgtermiņā un veikt instrumentālo bišu māšu apsēklošanu visas biškopības sezonas garumā, būtiski atvieglojot arī apsēklošanas pakalpojuma pieejamību, biškopības nozarē praksē ir nepieciešams ieviest ilgtermiņa medus bišu tranu spermas uzglabāšanas metodes. Pētījumi par bišu tranu spermas ilgtermiņa uzglabāšanu sākās jau 1970-tajos gados. Izteikti lielāka aktivitāte saistībā ar kriosaldēšanas procesa uzlabošanu, ķīmisko reaģentu toksicitātes samazināšanu, spermas kvalitātes un bišu māšu auglības saglabāšanu un citiem aspektiem parādījās pēdējos 20 gados. 2021. gadā plašāk tika apsvērta arī ideja par Eiropas pirmās gēnu bankas izveidi tieši medus bišu genofonda saglabāšanā.

Spermas kvalitātes un bišu māšu auglības rādītāju nozīme.

Bišu māte ir vienīgais īpatnis bišu saimē, kas dēj apaugļotas olas un nodrošina bišu saimē paaudžu nomaiņu. Attiecīgi no apaugļotām olām attīstās sievišķie īpatņi jeb darba bites un no neapaugļotām olām  - vīrišķie īpatņi jeb trani. Darba bites pilda barošanas, šūnu tīrīšanas, šūnu būvēšanas, barības vākšanas, ligzdas aizsargāšanas funkciju un nepieciešamības gadījumā no apaugļotas olas audzē jaunu bišu māti, lai aizstātu esošo. Darba bišu mūža ilgums variē no 21 dienas aktīvajā sezonas periodā līdz 6 mēnešiem ziemošanas periodā. Savukārt tranu vienīgais uzdevums ir veiksmīgi apsēklot jaunas bišu mātes un nodot savus gēnus nākamajām paaudzēm citā bišu saimē. Tranus bišu saime audzē un uztur tikai dažus mēnešus, kamēr sezonāli ir iespējama jauno bišu māšu dabīgā apsēklošanās. Sezonas ietvaros parasti tranu īpatsvars bišu saimē ir 5%, kas var mainīties atkarībā no bišu mātes vecuma vai bišu mātes organismā esošās spermas daudzuma un kvalitātes. Bišu saimes funkcionalitātes saglabāšanā būtiska loma ir bišu mātes auglības rādītājiem, kas ietver apaugļotu olu jeb darba bišu peru īpatsvaru no kopējā olu skaita, dēšanas kvalitāti un dēšanas ilgumu, ko tiešā veidā ietekmē tranu spermas kvalitāte.

A. Spermas šūnu skaits bišu mātes spermas uzkrājējā. Bišu māte 5-14 dienu vecumā dodas “kāzu” lidojumos, lai apsēklotos ar vairākiem traniem un uzkrātu spermu visam turpmākajam mūžam vairākiem gadiem. Bišu mātes mūžs ir tiešā veidā atkarīgs no spermas šūnu skaita spermas uzkrājējā, ja māte sāk dēt vairāk neapaugļotas olas, no kurām attīstās trani, esošās darba bites veic bišu mātes nomaiņu, lai saglabātu bišu saimes dzīvotspēju. Dabīgi apsēklotām bišu mātēm spermas uzkrājējā nonāk vidēji 4 līdz 5 miljoni spermas šūnas (var variēt no 2 līdz 7 miljoni). Savukārt par kvalitatīvi instrumentāli apsēklotu bišu māti var uzskatīt, ja spermas uzkrājējā ir nonākuši vismaz 3 miljoni spermas šūnu, kas būtu pietiekams daudzums bišu mātes darba mūžam. Ja spermas uzkrājējā šūnu skaits ir mazāks par 0.5 miljoniem šūnu, pastāv risks, ka bišu māte sāks dēt tikai neapaugļotas olas. Lai noteiktu spermas šūnu skaitu spermas uzkrājējā, bišu mātes ne agrāk kā 48 h pēc instrumentālās apsēklošanas tiek preparētas. Tas galvenokārt saistīts ar to, ka pēc apsēklošanas pirmās 40 h bišu mātes organismā notiek tranu spermas migrēšana no vidus olvadiem uz speciālu spermas uzglabāšanai paredzētu orgānu – spermas uzkrājēju. Spermas uzkrājējs parasti tiek pārplēsts un sperma atšķaidīta ar kādu šķīdinātāju, piem., ar kālija jonu buferšķīdumu (Kiev solution). Pēc tam paraugu apskata mikroskopā 400 x palielinājumā un veic šūnu skaitīšanu un aprēķina šūnu skaitu spermas uzkrājējā. Spermas šūnu skaits bišu mātes spermas uzkrājējā ir būtisks tranu spermas kvalitātes (arī apsēklošanas) rādītājs, no kura ir atkarīgs bišu mātes darba mūža ilgums un sniegums, tāpēc to izmanto pētījumos kā vienu spermas kvalitātes raksturojošo lielumu.

B. Spermas kustīgums (motility). Lai sperma nonāktu bišu mātes spermas uzkrājējā un pēc tam vēlāk veiksmīgi notiktu arī olu apaugļošana, būtisks spermas kvalitātes rādītājs ir spermas kustīgums. Kustīgums ir viens no visbiežāk pārbaudītajiem spermas kvalitātes rādītājiem pētījumos. Tiek uzskatīts, ka pēc kustīguma var patiesāk izdarīt secinājumus par spermas veiktspēju nekā tikai pēc spermas dzīvotspējas rādītājiem. Medus bišu tranu spermai ir raksturīgas gan apļveida kustības, gan pēkšņa vibrēšana. Kustīguma noteikšanu veic tāpat kā spermas šūnu skaitīšanu. Paraugu atšķaida ar šķīdinātāju un apskata zem mikroskopa 400x palielinājumā un procentos izsaka,  cik daudz no kopējā spermas šūnu skaita paraugā veido apļveida kustības un vibrē. Kustīgumu mēdz noteikt gan spermas paraugos pirms to pielietošanas instrumentālai bišu māšu apsēklošanai, gan arī pēc bišu māšu apsēklošanas, nosakot kustīgumu spermas uzkrājējā. Ļoti vērtīgi kustīgumu ir noteikt tieši pirms bišu māšu apsēklošanas, lai izvairītos no neefektīva darba un laika resursu patēriņa, kas tiek veltīts bišu mātes instrumentāli apsēklojot, kā arī veicot pēc apsēklošanas monitoringu un vērtēšanu.

C. Spermas dzīvotspēja (plazmas membrānu integritāte). Visbiežāk noteiktais spermas kvalitātes rādītājs ir spermas dzīvotspēja. Pētījumos, izmantojot bišu māšu apsēklošanai spermas paraugus, kuros ir sajaukta dažādās proporcijās svaiga un saldēta sperma (nedzīvas spermas šūnas), noteica, ka spermas paraugos vismaz 46% spermas šūnām jābūt dzīvām, lai bišu māte pēc apsēklošanas vismaz 1 sezonu dētu apaugļotas olas. Svaigas tranu spermas dzīvotspēja var būt krasi svārstīties no 55% līdz 99%. Spermai nonākot bišu mātes spermas uzkrājējā, tās dzīvotspēja samazinās par 10%. Jāņem vērā, ka dzīvotspējas rādītāji var mainīties atkarībā no tranu vecuma, to barošanas, vides u.c. faktoriem. Arī bišu mātes organismā spermas uzkrājējā spermas dzīvotspēja var mainīties, vidēji tā ir 80-98%, taču pieaugot mātes vecumam, tā var samazināties. Spermas dzīvotspēju nosaka pēc spermas šūnu ārējā apvalka - plazmas membrānas caurlaidības. Ja spermas šūnas ir bojātas, šūnu membrānu caurlaidība ir lielāka nekā veselām šūnām. Attiecīgi spermas paraugus iekrāso ar dažādām vielām, piem., fluorohromu - propidium iodine (PI), SYBR-14, Hoechst 33342 vai acridine orange, kas spēj šķērsot šūnu membrānas un saskarē ar DNS izdala sarkanu fluoriscējošu krāsu bojātās šūnās un zaļu vai zilu fluoriscējošu krāsu dzīvās šūnās. Pēc šūnu iekrāsošanās zem fluorescences mikroskopa vairākos parauga skata laukos tiek saskaitītas veselās un bojātās šūnas un to īpatsvars tiek izteikts procentuāli. Taču nosakot tikai spermas dzīvotspējas rādītāju, tas var sniegt nepatiesu informāciju par spermas kvalitāti. Ja arī tiek iegūts patiess dzīvotspējas rādītājs paraugā, nav garantijas, ka dzīvās šūnas ir arī funkcionējošas (kustīgas) šūnas.

Lai novērtētu spermas kvalitāti, pētījumos nosaka arī citus rādītājus, taču iepriekš 3 aprakstītie rādītāji ir svarīgākie no tiem. Spermas dzīvotspēju, kustīgumu, šūnu skaitu bišu mātes spermas uzkrājējā un mātes auglību (darba bišu peru īpatsvaru) izmanto kā mērauklu tranu spermas uzglabāšanas metodēm. Jo augstāki būs tranu spermas rādītāji un bišu māšu auglības rādītāji, izmantojot spermu, kas ir saldēta/nesaldēta un ilgstoši uzglabāta, jo labāka metode spermas uzglabāšanai būs atrasta. Uzlabojot uzglabāšanas metodes, būs iespējams ilgstoši uzglabāt tranu spermu un pēc vajadzības atjaunot ģenētisko materiālu, apsēklojot ar uzglabāto spermu bišu mātes un pēc tam ataudzējot nākamās paaudzes bišu mātes. Tas arī ir spermas ilgtermiņa uzglabāšanas galvenais mērķis - iegūt auglīgus pēcnācējus un nodrošināt ģenētiskā fonda atjaunošanu.

Līdz šim galvenie atklājumi medus bišu tranu spermas uzglabāšanai ilgtermiņā:

• Vairākas desmitgades kā visbiežāk lietotais spermas šķīdinātājs spermas saldēšanai tiek izmantots Harbo šķīdinātājs.
• Spermas paraugiem saldēšanas procesā tiek lietotas vielas – krioprotektanti, kas pasargā spermas šūnas no aukstuma šoka un kristālu veidošanās šūnās saldēšanas procesā. Vislabāk šo lomu izpilda viela – dimetilsulfoksīds (DMSO) ar koncentrāciju 10% gala paraugā. Lai samazinātu spermas šūnu osmotisko stresu un negatīvos blakusefektus, kas mēdz būt krioprotektantiem, saldēšanas metožu darba gaitā izmanto dialīzi jeb pakāpenisku vielas pievienošanu paraugam.
• Lai spermas paraugiem saglabātu augstus kvalitātes rādītājus (kustīgumu, dzīvotspēju), paraugu sasaldēšanai izmanto programmējamās saldētavas un saldē paraugu no +4°C līdz -40°C ar ātrumu 3°C/minūtē. Pēc tam paraugi tiek iemērkti un uzglabāti šķidrā slāpekļa (LN₂) tankos -196°C.
• Tiek meklēti un attīstīti lētāki, mobilāki, vieglāk lietojami alternatīvi risinājumi programmētajai spermas saldēšanai. Piemēram, paraugu saldēšanu veic šķidrā slāpekļa tvaikos vai arī tiek izmantoti dažādi paraugu iepakojumi, kas palēnina paraugu sasalšanas procesu.
• Līdz šim saldēti spermas paraugi ir uzglabāti un pārbaudīti pēc 343 dienām (izmantojot programmējamo saldēšanu), savukārt nesaldēta tranu sperma ir uzglabāta ar labiem rezultātiem  temperatūras diapazonā no +10°C līdz +25°C attiecīgi 2 nedēļas līdz pat 439 dienas (izmantojot dažādus stikla kapilāru pildījumus).
• Lai pētījumos samazinātu resursu patēriņu, kas nepieciešams, uzglabājot spermu, pārbaudot spermas kvalitāti, apsēklojot bišu mātes, veidojot nukleusus, veicot monitoringu un pēc tam veicot papildu spermas kvalitātes rādītāju noteikšanu bišu mātes spermas uzkrājējā, tiek meklētas likumsakarības starp sākotnējiem spermas kvalitātes rādītājiem un spermas kvalitātes rādītājiem bišu māšu spermas uzkrājējos un māšu auglību. Līdz šim ir atrasts, ka visspēcīgākā sakarība ir novērota spermas kustīgumam ar pārējiem spermas kvalitātes un māšu auglības rādītājiem, piem., jo augstāks kustīgums spermas sākotnējā paraugā, jo vairāk spermas šūnas ir nonākušas bišu mātes spermas uzkrājējā.

Pēdējo 22 gadu laikā ir vērojams straujš progress ilgtermiņa uzglabāšanas metožu attīstībā. Ir ieviestas inovācijas ar mērķi uzlabot spermas paraugu kvalitāti un bišu māšu auglības rādītājus, samazināt ķīmiskās un fizikālās apstrādes negatīvo ietekmi uz spermas šūnām un mātēm. Inovācijas tiek meklētas arī viegli lietojamām un zemu izmaksu metodēm, kas būtu plaši pieejamas biškopības nozarē.

Izmantotā literatūra: Smilga-Spalvina, A., Spalvins, K., & Veidenbergs, I. (2023) Review of Sustainable Cryopreservation and Above-Freezing Storage Solutions of European Honey Bee Drone Semen. Environmental and Climate Technologies, 27(1), 177-194. DOI: https://doi.org/10.2478/rtuect-2023-0014

Publicēts Latvijas Biškopības biedrības izdotajā žurnālā "Biškopis", 2023. gada 3. izdevums.